Signal Transduction and Targeted Therapy | CD3与pMHC双特异性纳米抗体T细胞衔接器靶向细胞内肿瘤抗原

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该研究通过开发TCRm Bi-NbTE平台，实现了对WT1和GPC3等细胞内肿瘤抗原的高效T细胞重定向，为解决传统T细胞衔接器靶点受限问题提供了创新策略，推动了基于CD3的免疫治疗在实体瘤中的应用。

 

文献概述

本文《TCR-mimic bispecific nanobody-based T cell engager targeting intracellular tumor antigens for cancer immunotherapy》，发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志，系统探讨了如何利用纳米抗体技术突破传统T细胞衔接器（TCE）在靶向细胞内肿瘤抗原方面的局限。作者构建了一种新型TCR模拟（TCRm）双特异性纳米抗体T细胞衔接器（TCRm Bi-NbTE），该分子能同时识别T细胞表面的CD3ε和肿瘤细胞表面由HLA-A*02:01呈递的特异性肽-MHC I类复合物（pMHC I），如HLA-A2/WT1和HLA-A2/GPC3。这一设计显著拓展了TCE可靶向的抗原范围，克服了传统单链可变片段（scFv）结构不稳定、易聚集的问题，并实现了对低密度pMHC复合物的有效识别。研究通过体外功能验证和多种小鼠异种移植模型（包括CDX和PDX）证实了其高特异性、强效抗肿瘤活性及良好安全性。

背景知识

当前癌症免疫治疗虽取得显著进展，但多数T细胞衔接器疗法受限于只能靶向细胞表面抗原，而超过70%的肿瘤特异性蛋白为细胞内或分泌型，无法被传统BiTE类药物触及。这一瓶颈严重限制了治疗适用范围，尤其是在实体瘤中。现有基于scFv的BiTE分子还面临结构不稳定性、生产难度大等问题。此外，CAR-T等细胞疗法虽能靶向细胞内抗原，但其制造复杂、成本高昂且存在脱靶毒性风险。因此，开发能够有效靶向细胞内肿瘤抗原的新一代T细胞衔接器成为迫切需求。本研究切入点在于利用纳米抗体（VHH）替代传统scFv，并结合TCR模拟抗体（TCRm）特异性识别pMHC复合物的能力，构建一种模块化、稳定且可扩展的双特异性平台。该策略不仅规避了VH-VL结构域错配问题，还实现了对WT1、GPC3等理想肿瘤相关抗原的精准识别，这些抗原在多种恶性肿瘤中高表达而在正常组织中几乎不表达，是理想的免疫治疗靶点。通过HLA-A2限制性识别，进一步增强了治疗的安全性和特异性。

 

针对肝细胞癌、卵巢癌等表达GPC3或WT1的肿瘤类型，可利用赛业生物的基因敲入与人源化小鼠模型服务构建精准疾病模型，用于TCRm Bi-NbTE等新型T细胞衔接器的药效评价。HUGO-GT®全基因组人源化模型可实现人类抗原的生理表达，更真实模拟肿瘤微环境，提升临床前研究预测性。

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研究方法与核心实验

作者采用基因工程技术将抗-CD3ε纳米抗体与识别HLA-A2/WT1或HLA-A2/GPC3复合物的TCRm纳米抗体通过柔性连接肽（Gly4Ser）融合，构建了TCRm Bi-NbTE分子。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)系统中表达，经包涵体纯化后复性获得功能性产物。利用流式细胞术验证其结合特异性，结果显示TCRm Bi-NbTE仅结合HLA-A2和相应肽段共表达的细胞，如OVCAR3、HepG2及脉冲后的T2细胞，而不结合抗原阴性或HLA不匹配细胞。生物层干涉（BLI）测定其对CD3ε和pMHC复合物的KD值分别为10⁻⁸ M量级，表明高亲和力结合。ELISA实验证实其可同时结合两个靶点，无空间位阻。

在功能验证中，作者使用PBMC来源的T细胞与肿瘤细胞共培养体系，评估T细胞激活标志物（CD25、CD69）、脱颗粒（CD107a）、增殖（CFSE稀释）及细胞因子分泌（IL-2、IFN-γ）。结果显示TCRm Bi-NbTE显著诱导抗原依赖性T细胞激活和效应功能。体外杀伤实验显示其在E:T比为10:1时对pMHC⁺细胞具有剂量依赖性杀伤活性，而对pMHC⁻细胞无影响。动物模型方面，采用NOD/SCID小鼠构建CDX（HepG2-Luc、OVCAR3）和PDX模型，经尾静脉注射人PBMC后给予TCRm Bi-NbTE治疗。结果显示治疗组显著抑制肿瘤生长、延长生存期，且无明显毒性。组织学分析显示肿瘤内T细胞浸润增加、Ki-67降低、凋亡升高。转录组分析揭示T细胞活化、细胞毒性相关基因上调，支持其作用机制。

关键结论与观点

• TCRm Bi-NbTE能特异性结合CD3ε和HLA-A2/WT1或HLA-A2/GPC7复合物，且不与无关pMHC结合，表明其具有高度抗原特异性，为后续设计针对其他pMHC靶点的T细胞衔接器提供了模板。
• 该分子在体外可高效激活T细胞，诱导IFN-γ和IL-2分泌，并介导抗原特异性细胞毒作用，提示其在过继免疫治疗中具有作为“现成”药物的潜力。
• 在CDX和PDX模型中，TCRm Bi-NbTE显著抑制肿瘤生长并延长生存期，且无明显肝酶升高或体重下降，表明其具有良好的体内疗效和安全性，支持其进入临床开发阶段。
• 转录组分析显示治疗后肿瘤微环境中T细胞活化和细胞毒性信号通路显著上调，同时伴随适度耗竭标志物表达，提示持续T细胞应答，为后续联合免疫检查点阻断策略提供了理论依据。
• 该平台采用全纳米抗体架构，具有高稳定性、易于原核表达和低免疫原性优势，相比传统scFv更利于规模化生产，为后续工业化制备奠定了基础。

研究意义与展望

该研究标志着T细胞衔接器技术向靶向细胞内抗原迈出关键一步。通过整合TCRm特异性与纳米抗体优势，TCRm Bi-NbTE平台可广泛应用于多种HLA-A*02:01阳性肿瘤，如肝癌、卵巢癌、白血病等，极大拓展了免疫治疗的靶点谱。对于药物开发而言，此模块化设计允许快速重定向至其他pMHC复合物，加速新药发现。在临床监测中，可通过检测pMHC表达状态筛选潜在获益患者，实现精准治疗。此外，该平台为构建通用型“off-the-shelf”免疫疗法提供了新路径，避免个体化细胞治疗的高成本和长周期问题。未来研究需在人源化免疫系统模型中进一步评估其安全性和抗肿瘤活性，并探索与PD-1/PD-L1抑制剂等联合治疗的可能性。

 

为加速TCRm Bi-NbTE类双特异性分子的临床前验证，赛业生物提供免疫系统人源化小鼠模型服务，可在C-NKG背景上移植人PBMC或HSC，重建功能性人类免疫系统，支持评估T细胞介导的抗肿瘤免疫应答及潜在细胞因子释放综合征（CRS）风险。

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结语

本研究成功开发了一种基于纳米抗体的双特异性T细胞衔接器——TCRm Bi-NbTE，能够特异性识别由HLA-A*02:01呈递的细胞内肿瘤抗原肽段，如WT1和GPC3，并有效激活T细胞清除肿瘤。这一创新策略突破了传统T细胞疗法仅限于表面抗原的瓶颈，为实体瘤和血液瘤治疗开辟了新路径。其模块化、稳定且可扩展的设计，使得快速开发针对不同pMHC靶点的免疫药物成为可能，具有显著的临床转化前景。在实验室层面，该平台为研究T细胞对pMHC响应机制提供了新工具；在临床层面，它有望成为一种“现成”的免疫治疗药物，降低治疗成本，惠及更多患者。尤其对于表达WT1或GPC3的难治性肿瘤，该技术可能重塑当前治疗格局，成为未来精准免疫治疗的重要基石。随着更多pMHC特异性纳米抗体的开发，这一平台有望覆盖广泛肿瘤类型，推动个性化癌症免疫治疗进入新纪元。

 

Ziqiang Ding, Shuyang Sun, Xiaomei Yang, Aiqun Liu, and Xiaoling Lu. TCR-mimic bispecific nanobody-based T cell engager targeting intracellular tumor antigens for cancer immunotherapy. Signal Transduction and Targeted Therapy.